Wolf K45E Instrukcja Użytkownika Strona 45
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Material und Methoden
_____________________________________________________________________________________
38
Reagenz C ddCTP, Tris HCl pH 9,5,
Magnesiumchlorid, Tween™ 20,
Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,
dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,
thermostabile Pyrophosphatase,
Thermo Sequenase DNA Polymerase
Reagenz G ddGTP, Tris HCl pH 9,5,
Magnesiumchlorid, Tween™ 20,
Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,
dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,
thermostabile Pyrophosphatase,
Thermo Sequenase DNA Polymerase
Reagenz T ddTTP, Tris HCl pH 9,5,
Magnesiumchlorid, Tween™ 20,
Nonidet™ P-40, 2-Mekaptoethanol,
dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP,
thermostabile Pyrophosphatase,
Thermo Sequenase DNA Polymerase
Formamid loading dye Formamid, EDTA, Methylviolett
•
Oligonukleotid-Primer (Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala/Schweden)
•
DEPC-H
2
O
•
TBE-Puffer 0,6x
2.7.3 Durchführung
In der vorliegenden Arbeit wurden all die Patientenproben sequenziert, die in
der vorangegangenen SSCP-Analyse durch abberante Bandenmuster auffielen.
Die Sequenzierung besteht aus drei Arbeitsschritten: 1. PCR mit Sequenz-
Primern, 2. DNA-Aufarbeitung und Cycle-Reaktion und 3. Sequenzierung.
Am Anfang steht die PCR mit den in Abschnitt 2.7.1 beschriebenen
modifizierten Sequenz-Primern. Dabei wird die doppelte Menge an DNA
verwendet, um genügend Material für die Sequenzierung zu gewinnen. Da die
optimalen Bedingungen je nach Primer unterschiedlich sind, sind diese vorher
- Salzverlusttubulopathien 1
- Abkürzungen 6
- 1 Einleitung 8
- Einleitung 2 9
- Einleitung 3 10
- Einleitung 4 11
- Einleitung 5 12
- Einleitung 6 13
- Einleitung 8 15
- Einleitung 9 16
- Einleitung 11 18
- 1.3 Zielsetzung dieser Arbeit 19
- Genomische Organisation des 22
- Einleitung 16 23
- 2 Material und Methoden 24
- 2.2 Allgemeine Materialien 25
- 2.3 DNA-Gewinnung 27
- Material und Methoden 28
- 2.5 Gelelektrophorese 33
- 2.6 SSCP-Analyse 35
- SSCP-Auswer 40
- Patientenprobe mit Band-Shift 40
- 2.7 DNA-Sequenzierung 41
- G A T C 43
- 3 Ergebnisse 49
- Ergebnisse 53
- Tabelle 3.5 78
- Mutation 85
- Ins(TCT)TCAGGCTTC + 85
- Del(TCT)CAGAGCATCACA + C346A 85
- Stop (ochre) 86
- Tyr 86
- 4 Diskussion 92
- Diskussion 100
- 4.2 Das ClC-Kb-Gen ( 101
- Abbildung nicht dargestellt 103
- 4.3 Pathophysiologie 108
- 4.4 Schlussbetrachtung 109
- 5 Zusammenfassung 112
- Zusammenfassung 113
- 6 Literaturverzeichnis 114
- 7 Anhang 126
- 7.3 Danksagung 130
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