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Material und Methoden

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Präparation zwischen 1,7 und 2,0 liegen. Um Meßungenauigkeiten

auszugleichen, sollten drei unabhängige Messungen durchgeführt und daraus

der Mittelwert bestimmt werden. Zur Einstellung der Stammlösung wird die

Probe mit DEPC-H

2ELVDXIHLQH.RQ]HQWUDWLRQYRQQJOYHUGünnt.

2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.4.1 Beschreibung

Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Verfahren, das der selektiven

Vermehrung (Amplifikation) von DNA-Abschnitten dient und bei deren DNA-

Synthesen durch die Verwendung von DNA-Polymerasen, die dem Verfahren

seinen Namen geben, auf den Gebrauch von lebenden Zellen und Bakterien

verzichtet werden kann. Das Prinzip beruht auf der enzymatischen Vermehrung

eines vorliegenden DNA-Abschnittes, der millionenfach angereichert wird, um

so in genügender Menge für Untersuchungen, wie z.B. den Nachweis von

Mutationen, zur Verfügung zu stehen [WHITE et al. 1989].

Zur Initiierung der DNA-Synthese werden Oligonukleotid-Primer verwendet, die

im Verlauf der zyklischen Reaktion immer wieder außerhalb des zu

replizierenden Abschnittes binden müssen. Der Einsatz der PCR setzt daher

die Kenntnis der Nukleotid-Sequenzen beidseits des zu untersuchenden DNA-

Abschnitts voraus. Um den gewünschte DNA-Abschnitt spezifisch zu gewinnen,

benutzt man flankierende Oligonukleotid-Primer, die gegenläufig an den

komplementären Strängen binden. Die eigentliche Reaktion besteht aus sich

wiederholenden Zyklen der Denaturierung, der Hybridisierung der Primer und

schließlich der Elongation, d.h. der DNA-Synthese.

Aufgrund der hohen Temperaturen insbesondere während der Denaturierung

und der DNA-Synthese mussten in der Anfangszeit nach Etablierung der

Methode dem Reaktionsansatz nach jedem Amplifikationsschritt neue

Enzymproben hinzugegeben werden [MULLIS u. FALOONA 1987]. Heute

benutzt man thermostabile Polymerasen, die eine Aufeinanderfolge vieler

Reaktionsschritte zulassen und das Verfahren maßgeblich erleichtern und vor

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Brak uwag

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