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Material und Methoden

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2.3.2 DNA-Isolierung aus Vollblut

Für die DNA-Isolierung werden 5-10 ml EDTA-Blut benötigt. Um eine vorzeitige

Zellschädigung zu vermeiden, sollte das Blut entweder innerhalb kurzer Zeit

verarbeitet oder bei –80°C tiefgefroren werden. Nach der Überführung des

Blutes in ein 50 ml Röhrchen wird es mit 4 Volumenanteilen der Lösung A

versetzt, 4 Minuten im Überkopfdreher geschüttelt und anschließend weitere 4

Minuten bei 1300g und 4°C zentrifugiert. Daraufhin wird der Überstand

vorsichtig dekantiert und das Pellet in 2 ml Lösung resuspendiert. Man überführt

die Zellsuspension in ein 5-ml-Röhrchen und versetzt diese zur

(QWSURWHLQLHUXQJPLWO1DWULXP3HUFKORUDW'DV*HPLVFKZLUGHLQLJH0DOH

vorsichtig geschüttelt.

Zu Beginn der folgenden DNA-Extraktion werden der Suspension 2 ml

Chloroform zugefügt und das Ganze wiederum einige Minuten behutsam

geschüttelt. Nach Zugabe von 300 O 1XFOHRQ 5HVLQ 6LOLFD/ösung wird für

mindestens 3 Minuten bei 1300g und 4°C zentrifugiert, anschließend der

Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen überführt und das Proteinpellet

verworfen. Zum Überstand wird gekühltes Ethanol absolut im Verhältnis 1:2

gegeben und das Röhrchen vorsichtig geschüttelt. Es kommt zur Präzipitation

der DNA, sichtbar als feines Netzwerk. Die ausgefallene DNA wird mit einer

Pasteurpipette isoliert, mindestens zweimal mit gekühltem 70% Ethanol

gewaschen und in einem offenen 1,5-ml-Eppendorfröhrchen bei

Raumtemperatur über Nacht und anschließend in einer Vakuumzentrifuge

JHWURFNQHW'LHJHWURFNQHWH'1$ZLUGMHQDFK0HQJHPLWO7(3XIIHU

resuspensiert und bei -20°C aufbewahrt.

Die Bestimmung der Konzentration der DNA wird nach vollständiger

Resuspension mit Hilfe eines Spektralphotometers bei 260 nm durchgeführt, da

die heterozyklischen, stickstoffhaltigen Basen bei dieser Wellenlänge ihr

Absorptionsmaximum haben. Hierbei entspricht die Extinktion [E] von 1,0 bzw.

 2' RSWLVFKH 'LFKWH (LQKHLW HLQHU .RQ]HQWUDWLRQ YRQ  JPO

doppelsträngiger DNA. Zur Untersuchung der Probe auf mögliche

Verunreinigungen mit Proteinen, deren Absorptionsmaximum bei 280 nm liegt,

wird zusätzlich die Extinktion bei dieser Wellenlänge bestimmt. Der Quotient E

260

280

gibt die Reinheit der Probe an und sollte bei einer sauberen DNA-

1 2 ... 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 ... 130 131

Brak uwag

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