Wolf K45E Instrukcja Użytkownika Strona 31
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Material und Methoden
_____________________________________________________________________________________
24
der Reverse-Primer aus einer DNA-Basensequenz des Reverse-Stranges im
3`-Bereich. Zu Beginn wird ein Reaktionsgemisch angesetzt, welches aus dem
Forward- und dem Reverse-Primer, Reaktionspuffer, Dinukleosidtriphosphaten,
und Taq-Polymerase besteht. Eine definierte Menge dieses
5HDNWLRQVJHPLVFKHV O ZLUG DXI MHZHLOV O GHU ]X XQWHUVXFKHQGHQ '1$
gegeben.
,QHLQHP*HVDPWYROXPHQYRQOEHILQGHQVLFK
O DNA
O DEPC-Wasser
O Forward-Primer
O Reverse-Primer
O dNTP
O Puffer
O Taq-Polymerase
Zu Beginn der Reaktion wird die DNA initial für 5 Minuten bei 95°C denaturiert
und dabei in ihre Einzelstränge aufgespalten. In der sich anschließenden
Zyklusphase kommt es mit jedem durchlaufenen Zyklus zu einer Verdopplung
der DNA-Menge. Der Zyklus selbst besteht aus drei aufeinander abgestimmten
Teilreaktionen, für die jeweils unterschiedliche Temperaturen erforderlich sind.
Zu Beginn eines jeden Zyklus wird für 45 Sekunden bei 94°C denaturiert. Für
den nächsten Schritt des so genannten Annealing (Hybridisierung der Primer
oder Anheftung) wird bis auf eine für den Primer spezifische Temperatur, die
vorher experimentell ermittelt werden muss und meistens zwischen 50°C und
65°C liegt, abgekühlt. Diese Temperatur wird für weitere 30 Sekunden gehalten
und anschließend für den Schritt der Elongation (DNA-Synthese) für 45
Sekunden auf 72°C angehoben. Während dieser Zeit heftet die Taq-
Polymerase Nukleotide an die 3`-OH-Primer-Enden und es werden somit zwei
komplementäre Stränge synthetisiert. Diese Zyklen werden 30 mal wiederholt.
Die PCR endet mit einem Kettenverlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C.
Die PCR-Produkte werden vom Gerät auf 4°C heruntergekühlt und im
Folgenden bis zum weiteren Gebrauch bei 4°C bis –20°C gelagert.
Abweichungen vom oben genannten Schema werden an entsprechender Stelle
- Salzverlusttubulopathien 1
- Abkürzungen 6
- 1 Einleitung 8
- Einleitung 2 9
- Einleitung 3 10
- Einleitung 4 11
- Einleitung 5 12
- Einleitung 6 13
- Einleitung 8 15
- Einleitung 9 16
- Einleitung 11 18
- 1.3 Zielsetzung dieser Arbeit 19
- Genomische Organisation des 22
- Einleitung 16 23
- 2 Material und Methoden 24
- 2.2 Allgemeine Materialien 25
- 2.3 DNA-Gewinnung 27
- Material und Methoden 28
- 2.5 Gelelektrophorese 33
- 2.6 SSCP-Analyse 35
- SSCP-Auswer 40
- Patientenprobe mit Band-Shift 40
- 2.7 DNA-Sequenzierung 41
- G A T C 43
- 3 Ergebnisse 49
- Ergebnisse 53
- Tabelle 3.5 78
- Mutation 85
- Ins(TCT)TCAGGCTTC + 85
- Del(TCT)CAGAGCATCACA + C346A 85
- Stop (ochre) 86
- Tyr 86
- 4 Diskussion 92
- Diskussion 100
- 4.2 Das ClC-Kb-Gen ( 101
- Abbildung nicht dargestellt 103
- 4.3 Pathophysiologie 108
- 4.4 Schlussbetrachtung 109
- 5 Zusammenfassung 112
- Zusammenfassung 113
- 6 Literaturverzeichnis 114
- 7 Anhang 126
- 7.3 Danksagung 130
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